刺萼龙葵ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选

刺萼龙葵ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选(毕业论文10200字)
摘  要：以刺萼龙葵基因组DNA为模板，利用正交设计，对影响简单序列重复区间扩增-聚合酶链式反应（ISSR-PCR）的主要因素（Taq酶、Mg2+浓度、dNTP、引物及模板DNA）进行筛选和优化，建立适合刺萼龙葵ISSR-PCR反应体系。优化后的ISSR-PCR反应体系为：20 ul反应体系包括ddH2O 5.4 ul，10×PCR Buffer（Mg2+ Free）2 ul，MgCl2（1.25mM）1.6 ul，1uM引物1.6 ul，dNTP（1.25mM each）6.4ul，rTaq酶（0.5U/ul）1ul，模板(20ng/ul) 2ul。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性45，50℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次，72℃延伸8min，16℃保存。这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行刺萼龙葵鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础。
关键词：刺萼龙葵、外来入侵植物、ISSR-PCR、正交设计、引物筛选

Optimization of an ISSR-PCR System and Primer Screening for Solanum rostratum Dun
Abstract: Template DNA used for ISSR was extracted from Solanum rostratum leaf tissue. The orthogonal design was applied to optimize ISSR amplification system of five factors (Taq DNA polymerase, Mg2+, dNTP, DNA template and primer concentration) respectively. An optimal reaction system was established, 20μl reaction system contained ddH2O 5.4ul, 10×PCR Buffer(Mg2+ Free) 2ul, Mg2+ (1.25mM) 1.6ul, 1uM primer 1.6ul, dNTP (1.25mM) 6.4ul, (0.5U/ul)rTaq polymerase 1ul, (20ng/ul) DNA 2ul. The PCR amplification program included pre-denaturation at 94℃ for 5min; denaturation at 94℃for 45s; annealing at 50.0℃ for 1 min; extending at 72℃ for 1 min; after 35 cycles, the product was extended at 72℃ for 8 min and finally maintained at 16℃. This optimal system lay the standardization program for the identification of Solanum rostratum and the genetic diversity analysis of its germplasm resource.
Keywords：Solanum rostratum Dun ；invasive plant ；ISSR-PCR；Orthogonal design; primer screening

目   录
摘要    1
关键词    1
1  前言    2
1.1  刺萼龙葵简介    2
1.1.1  刺萼龙葵的形态学特征    2
1.1.2  刺萼龙葵的生物学与生态学特性    3
1.1.3  刺萼龙葵的为害    3
1.1.4  刺萼龙葵的分布现状    3
1.2  ISSR分子标记技术简介    3
1.2.1  ISSR技术的原理    4
1.2.2  ISSR分子标记技术优缺点    5
1.2.3  ISSR技术在植物上的应用    5
1.2.4  研究目的及意义    6
2  材料与方法    6
2.1  试验材料    6
2.2  酶、试剂及仪器    6
2.3  方法    7
2.3.1  刺萼龙葵基因组DNA的提取    7
2.3.2  基因组DNA浓度和纯度的检测    7
2.3.3  ISSR—PCR反应体系的建立与优化    8
3  结果与分析    10
3.1  刺萼龙葵基因组DNA电泳检测    10
3.2  刺萼龙葵基因组DNA分光光度计检测    10
3.3  正交设计直观分析    11
4  讨论    12
4.1  影响DNA质量的因素    12
4.2  刺萼龙葵ISSR-PCR反应体系    13
5  结论    14
参考文献    14
致谢    16